Нокаут гена миостатина у карпа обыкновенного с помощью системы CRISPR/Cas9

Цель работы: разработка метода нокаута двух паралогичных копий гена миостатина с помощью CRISPR/ Cas9-системы с доставкой редактирующего комплекса в зиготу карпа обыкновенного методом микроинъекций.

Материалы и методы: оплодотворение икры карпа обыкновенного проводили in vitro, sgRNA синтезировали методом ПЦР с перекрывающимися олигонуклеотидами и последующей транскрипцией, редактирующий комплекс, состоящий из sgRNA и эндонуклеазы Cas9, доставляли в зиготу карпа до первого дробления методом микроинъекций, область, включающую сайт редактирования, амплифицировали методом гнездовой ПЦР, события редактирования детектировали методами секвенирования по Сэнгеру и NGS-секвенирования.

Новизна: впервые в России разработана система нокаута гена миостатина карпа обыкновенного, позволяющая одновременно изменять обе паралогичные копии гена.

Результат: получено 12 особей F0 карпа обыкновенного с нокаутом гена миостатина.

Практическая значимость: опробован методологический подход, позволяющий достаточно быстро и контролируемо получать особей карпа обыкновенного с запрограммированными мутациями. Криспанты по гену миостатина отличаются повышенной скоростью роста мышечной массы за счёт гипертрофии и гиперплазии мышечных волокон, что приводит к повышению качества филе рыбы. Популяции быстро растущих рыб более удобны для выращивания в условиях аквакультуры, чем популяции со стандартной скоростью роста.

1. Chen H., Wang J., Du J., Mandal B. K., Si Zh., Xu X., Yang H., Wang Ch. 2021. Analysis of recently duplicated TYRP1 genes and their effect on the formation of black patches in Oujiangcolor common carp (Cyprinus carpio var. color) // Anim. Genet. V. 52. P. 451-460. DOI: 10.1111/age.13071

2. Chen H., Wang J., Du J., Si Z., Yang H., Xu X., Wang C. 2019. ASIP disruption via CRISPR/Cas9 system induces black patches dispersion in Oujiang color common carp // Aquaculture. V. 498. P. 230-235. DOI: 10.1016/j.aquaculture.2018.08.057

3. Chen L., Li C., Li B., Zhou X., Bai Y., Zou X., Zhou Z.. et al. 2024. Evolutionary divergence of subgenomes in common carp provides insights into speciation and allopolyploid success // Fundamental Research. V. 4. P. 589-602. DOI: 10.1016/j.fmre.2023.06.011

4. Concordet J.-P., Haeussler M. 2018. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens // Nucleic. Acids. Res. V. 46. P. W242-W245. DOI: 10.1093/nar/gky354

5. Doudna J. A., Charpentier E. 2014. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 // Science V. 346(6213). P. 12580-96. DOI: 10.1126/science.1258096

6. Guo C., Ma X., Gao F., Guo Y. 2023. Off-target effects in CRISPR/ Cas9 gene editing // Front. Bioeng. Biotechnol. V. 11. P. 1143-157. DOI: 10.3389/fbioe.2023.1143157

7. Ivanova N. V., Deward J. R., Hebert P. D.N. 2006. An inexpensive, automation-friendly protocol for recovering high-quality DNA // Molecular Ecology Notes. V. 6(4). P. 998-1002. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2006.01428.x

8. Kearse M., Moir R., Wilson A., Stones-H avas S., Cheung M., Sturrock S., Buxton S., Cooper A., Markowitz S. et al. 2012. Geneious Basic: An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data // Bioinformatics V. 28(12). P. 1647-2164. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts199

9. Labun K., Montague T. G., Krause M., Torres Cleuren Y. N., Tjeldnes H., Valen E. 2019. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing // Nucleic. Acids.Res. V. 47. P. W171-W174. DOI: 10.1093/nar/gkz365

10. Mandal B. K., Chen H., Si Z., Hou X., Yang H., Xu X., Wang J., Wang C. 2020. Shrunk and scattered black spots turn out due to mc1r knockout in a white- black Oujiang color common carp (Cyprinus carpio var. color) // Aquaculture. V. 518. P. 734-822. DOI: 10.1016/j.aquaculture.2019.734822

11. Orlova S.Yu., Ruzina M. N., Emelianova O. R., Sergeev A. A., Chikurova E. A., Orlov A. M., Mugue, N.S. 2024. In search of a target gene for a desirable phenotype in aquaculture: genome editing of Cyprinidae and Salmonidae species // Genes (Basel). V. 15. P. 726. DOI: 10.3390/genes15060726

12. Shahi N., Mallik S. K., Sarma D. 2022. Muscle growth in targeted knockout common carp (Cyprinus carpio) mstn gene with low off-target effects // Aquaculture. V. 547. 737423. DOI: 10.1016/j.aquaculture.2021.737423

13. Xu P. Zhang X., Wang X., Li J., Liu G., Kuang Y., Xu J., Zheng X., Ren L., Wang G., et al. 2014. Genome sequence and genetic diversity of the common carp, Cyprinus carpio // Nat Genet. V. 46. P. 1212-1219. DOI: 10.1038/ng.3098

14. Zhai G., Shu T., Chen K., Lou Q., Jia J., Huang J., Shi C., Jin X., He J., Jiang D. et al. 2022. Successful production of an all-female common carp (Cyprinus carpio L.) population using cyp17a1-deficient neomale carp // Engineering. V. 8. P. 181-189. DOI: 10.1016/j.eng.2021.03.026

15. Zhong Z., Niu P., Wang M., Huang G., Xu S., Sun Y., Xu X., Hou Y., Sun X., Yan Y. et al. 2016. Targeted disruption of sp7 and myostatin with CRISPR-Cas9 results in severe bone defects and more muscular cells in common carp // Sci. Rep. V. 6. P. 229-253. DOI: 10.1038/srep22953