Применение цитометрии для анализа качества спермы рыб на примере черноморского калкана

Цель работы: разработка способа оценки качества спермы рыб по состоянию митохондрий сперматозоидов, которые связаны с их функциональной подвижностью.

Метод: для оценки качества спермы половозрелых разновозрастных самцов черноморского калкана из нерестовой популяции впервые был применён цитометрический анализ с предварительной окраской живых образцов спермы флуоресцентным красителем родамином 123, характеризующим мембранный потенциал митохондрий сперматозоидов.

В результате исследований определена индивидуальная вариабельность концентрации, размерного состава и флуоресценции окрашенных родамином сперматозоидов в сперме 27 половозрелых разновозрастных самцов калкана из одной нерестовой популяции. Концентрация сперматозоидов (с размером головки 2,2 мкм) в семенной жидкости калкана составляла, в среднем, 2,8 ± 1,3 × 109 кл мл-1, и варьировала индивидуально в пределах от 0,56 до 4,98 × 109 кл мл-1. Доля флуоресцирующих (т. е. с окрашенными родамином 123 функциональными митохондриями) сперматозоидов составляла 86,3 ± 13,9% от совокупности всех сперматозоидов в образцах спермы. Внутри большой группы окрашенных родамином 123 сперматозоидов хорошо выделялась субгруппа более крупных (около 2,4 мкм), наиболее ярко флуоресцирующих и, по-видимому, наиболее метаболически активных сперматозоидов, доля которых составляла 16,2 ± 3,8%.

Научная и практическая значимость: разработанный цитометрический протокол обеспечивает более точную оценку функциональности сперматозоидов в сперме черноморского калкана и других видов рыб, и может быть применён для исследования состояния репродуктивных характеристик рыб из естественных популяций, селекции наилучших производителей при создании маточных стад для аквакультурной промышленности и оценки состояния спермы рыб до и после криоконсервации.

1. Воронина Е. П. 2010. К морфологии и систематике представителей семейства Scophthalmidae // Вопросы ихтиологии. Т. 50. № 6, с. 725-733. DOI: 10.1134/S00329452100090018.

2. Гирагосов В.Е. 2020. Формирование и реализация плодовитости у черноморского калкана Scophthalmus maeoticus (Scophthalmidae) на юго-западном шельфе Крымского полуострова // Вопросы ихтиологии. Т. 60. № 4. С. 442- 451. DOI:10.1134/S0032945220040050.

3. Копейка Е.Ф., Чепурнов А.В., Дрокин С.И., Владимирцев В.Б., Александров Ю.Г. 1987. Низкотемпературная пресервация спермы черноморских рыб (Psetta maеotica Pallas) и бычка (Neogobius melanostomus Pallas) // Криобиология. № 4. C. 48-49.

4. Марти Ю.Ю. 1939. Материалы к биологии черноморской камбалы-калкана (Rhombus maeoticus Pallas) // Cб. посвящ. науч. деятельности почетного члена АН СССР, засл. деятеля науки и техники Н.М. Книповича (1885-1939). М.: Изд-во АН СССР. С. 232-253.

5. Павлов Д.А. 2006. Метод оценки качества спермы рыб // Вопр. ихтиологии. Т. 46. № 3. С. 384-392. DOI: 10.1134/S0032945206050055.

6. Правдин И.Ф. 1966. Руководство по изучению рыб. М.: Пищ. пром-сть, 376 с.

7. Baiandina I., Giragosov V., Khanaychenko A. 2022. Male reproductive potential in the Black Sea turbot (Scophthalmus maximus) spawning populations // Fisheries Research. V.253:106367. DOI: 10.1016/j.fishres.2022.106367.

8. Barbagallo F., La Vignera S., Cannarella R., Aversa A., Calogero A.E., Condorelli R.A. 2020. Evaluation of sperm mitochondrial function: a key organelle for sperm motility // J. Clinical Medicine. V. 9. № 2. P. 363 (1-12). DOI:10.3390/jcm9020363.

9. Bian X., Zhang X., Gao T., Wan R., Chen S., Sakurai Y. 2010. Morphology of unfertilized mature and fertilized developing marine pelagic eggs in four types of multiple spawning flounders // Ichthyological Research. V. 57. № 4. P. 343-357. DOI 10.1007/s10228-010-0167-1.

10. Chanet B. 2003. Interrelationships of Scophthalmid fishes (Pleuronectiformes: Scophthalmidae) // Cybium. V 27. № 4. P. 275-286.

11. Chen S.L., Ji X.S., Yu G.C., Tian, Y. S., Sha, Z. X. 2004. Cryopreservation of sperm from turbot (Scophthalmus maximus) and application to large-scale fertilization // Aquaculture. V.236. P. 547-556. DOI: 10.1016/j.aquaculture.2003.10.027.

12. Cosson J. 2004. The ionic and osmotic factors controlling motility of fish spermatozoa// Aquaculture International. V. 12. P. 69-85. DOI:10.1023/B: AQUI.0000017189.44263.bc

13. Cosson J., Groison A.-L., Suquet M., Fauvel C., Dreanno C., Billard R. 2008. Studying sperm motility in marine fish: an overview on the state of the art // J. Appl. Ichthyol. V. 24. № 4. P. 460- 486. DOI: 10.3389/fmars.2019.00740.

14. Dreanno C., Suquet M., Desbruyeres E., Cosson J., Le Delliou H., Billard R. 1998. Effect of urine on semen quality in turbot (Psetta maxima) // Aquaculture. V. 169. № 3-4. P. 247-262. DOI: 10.1016/S0044-8486(98)00262-2.

15. Dreanno C., Cosson J., Suquet M., Seguin F., Dorange G, Billard R 1999. Nucleotide content, oxydative phosphorylation, morphology, and fertilizing capacity of turbot (Psetta maxima) spermatozoa during the motility period // Molecular reproduction and development: incorporating gamete research. V. 53. № 2. P. 230-243. DOI: 10.1002/(SI CI)1098-2795(199906)53:2<230:AID-MRD12>3.0.CO;2-H.

16. Dreanno C., Seguin F., Cosson J., Suquet M., Billard R. 2000. 1H-NMR and 31P-NMR analysis of energy metabolism of quiescent and motile turbot (Psetta maxima) spermatozoa // J. Experimental Zoology. V.286. № .5. P. 513-522. DOI: 10.1002/(SICI)1097-010X(20000401)286:5<513::AIDJEZ9>3.0.CO;2-5.

17. Drokin S. I. 1993. Phospholipid distribution and fatty acid composition of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in sperm of some freshwater and marine species of fish // Aquatic Living Resources. V. 6. № 1. P. 49-56.

18. Evenson D. P. , Darzynkiewicz Z. , Melamed M. R. 1982. Simultaneous measurement by flow cytometry of sperm cell viability and mitochondrial membrane potential related to cell motility // J. Histochem Cytochem. V. 30. № 3. P. 279-280. DOI: 10,1177/30,3,6174566.

19. Giragosov V.E., Khanaychenko, А.N. 2012. The state-of-art of the Black Sea turbot spawning population off Crimea (1998- 2010) // Turk. J. Fish. Aquatic Sciences. № 12 (Sp. Iss.). P. 377-383. DOI: 10.4194/1303-2712-v12_2_25. 9.

20. Gosz E., Mirny Z., Horbowy J., Ziętara M.S. 2010. Morphometry of turbot spermatozoa in relation to the location and time of capture during the spawning season // J. Applied Ichthyology. V.26. № 5. P. 784-788. DOI: 10.1111/j.1439-0426.2010.01547.x

21. Holt W. V., Van Look K. J.W. 2004. Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality // Reproduction. V. 127. № 5. P. 52-535. DOI: 10.1530/rep.1.00134.

22. Kowalski R. K., Cejko B. I. 2019. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors // Theriogenology. V. 135. P. 94-108. DOI: 10.1016/j. theriogenology.2019.06.009.

23. Liu Q. H., Li J., Zhang S. C., Xiao Z. Z., Ding F. H., Yu D. D., Xu X. Z. 2007. Flow cytometry and ultrastructure of cryopreserved red seabream (Pagrus major) sperm // Theriogenology. V.67. № 6. P. 1168-1174. DOI:10.1016/j.theriogenology.2006.12.013.

24. Liu Y., Liu Q., Xu S. Wang Y., Feng C., Zhao C., Song Z., Li J. 2021. A deep insight of spermatogenesis and hormone levels of aquacultured turbot (Scophthalmus maximus) // Frontiers in Marine Science 7: 592880. DOI: 10.3389/fmars.2020.592880

25. Ogier De Baulny O.B., Le Vern Y., Kerboeuf D., Maisse G. 1997. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa // Cryobiology. V.34. № 2. P. 141-149. DOI: 10.1006/cryo.1996.1992.

26. Paniagua-Chávez C.G., Jenkins J., Segovia M., Tiersch T. R. 2006. Assessment of gamete quality for the eastern oyster (Crassostrea virginica) by use of fluorescent dyes // Cryobiology. V.53. № .1. P. 128-138. DOI: 10.1016/j.cryobiol.2006.05.001.

27. Polat H., Kurtoglu İ. L. 2023. Effect of antioxidants on cryopreserved turbot (Scophthalmus maximus) spermatozoa quality and DNA damage // Turk. J. Fish. Aquat. Sci. V. 23. № 4, TRJFAS22300 DOI: 10.4194/TRJFAS22300.

28. Segovia M., Jenkins J.A., Paniagua-Chavez C., Tiersch T.R. 2000. Flow cytometric evaluation of antibiotic effects on viability and mitochondrial function of refrigerated spermatozoa of Nile tilapia // Theriogenology. V. 53. № 7. P. 1489-1499. DOI: 10.1016/j.cryobiol.2006.05.001.

29. Suquet M., Billard R., Cosson J., Dorange G., Chauvaud L., Mugnier C., Fauvel C. 1994. Sperm features in turbot (Scophthalmus maximus): a comparison with other freshwater and marine fish species // Aquatic Living Resources. V. 7. № 4. P. 283-294. DOI: 10.1051/alr:1994031.

30. Turan C., Ivanova P.P., Raykov V.S., Gurlek M., Erguden D. et al. 2019. Genetics structure analysis of turbot (Scophthalmus maximus, Linnaeus, 1758) in the Black and Mediterranean Seas for application of innovative management strategies // Frontiers in Marine Science. V. 6. Art. № . 740. P. 1-9. DOI: 10.3389/fmars.2019.00740.

31. Xu H., Huang L., Liang M., Zheng K., Wang X. 2015. Effect of dietary vitamin E on the sperm quality of turbot (Scophthalmus maximus) // J. Ocean University of China. V.14. P. 695-702. DOI 10.1007/s11802-015-2555-7.