Результаты апробации трёх пар праймеров для идентификации возбудителя фурункулёза лососевых рыб Aeromonas salmonicida методом ПЦР

Цель работы состояла в практической апробации нескольких разработанных ранее пар праймеров для идентификации возбудителя фурункулёза лососевых рыб Aeromonas salmonicida методом ПЦР.

Использованные методы: при апробации праймеров в качестве тестовых были использованы шесть бактериальных культур, выделенных от преднерестовой кеты, выловленной в реках на юге Сахалина. Для выделения бактериальной ДНК и подготовки ПЦР-смесей использовали готовые наборы D-Cells‑250 и Intifica TaqМ мастер-микс. Амплификацию осуществляли в термоциклере Т‑100 ThermoCycler (Bio-Rad). Детекцию продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере (ТАЕ). Для визуализации результатов и их документирования использовали систему Bio-Rad Gel DOC XR+SyStem.

По результатам работы экспериментально подтверждена видоспецифичность трёх пар праймеров, подобранных для идентификации возбудителя фурункулёза методом ПЦР. Апробация выбранных праймеров проведена на бактериальных культурах, выделенных от половозрелых особей кеты с проявлениями фурункулёза и без них. По итогам тестирования все бактериальные изоляты были отнесены к виду A. salmonicida.

Новизна работы: впервые выполнено сравнение праймеров, предложенных несколькими авторами для идентификации возбудителя фурункулёза, на бактериальных культурах, выделенных от лососей дальневосточного региона.

Практическая значимость: полученные результаты использованы для подготовки методических указаний по идентификации возбудителя фурункулёза лососевых рыб A. salmonicida методом ПЦР, позволяющим сократить сроки диагностики заболевания.

1. Викторов Д.А., Тороповский А.Н., Садртдинова Г.Н. 2018. ПЦР-тест-система для выявления и типирования возбудителей аэромонозов рыб // Рыбоводство и рыбное хозяйство. № 12 (155). С. 40-48.

2. Галанина Е. В., Ломакина А.В. 2012. Исследования заболеваемости фурункулёзом, вызванным инфицированием Aeromonas salmonicida, у лососевых рыб южной части о. Сахалин // Известия РАН. Серия биологическая. № 5. С. 1-7.

3. Головина Н.А., Стрелков Ю.А., Воронин В.Н., Головин П.П., Евдокимова Е.Б., Юхименко Л.Н. 2003. Ихтиопатология / Головина Н.А., Бауера О.Н. ред. М.: Мир. 448 с.

4. Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб. 1998. Часть 1. М.: Отдел маркетинга АМБ-агро. 310 с.

5. Устименко Е.А. Сергеенко Н.В. 2020. Возбудитель фурункулёза Aeromonas salmonicida у тихоокеанских лососей Камчатки // Труды ВНИРО. Т 182. С. 139-150. DOI: 10.36038/2307-3497-2020-182-139-150

6. Austin B., Austin D.A. 2016. Bacterial fish pathogens, disease of farmed and wild fish. 6th edn.: Springer. 732 p. DOI: 10.1007/978-3-319-32674-0

7. Beaz-Hidalgo R., Magi G.E., Balboa S., Barja J.L., Romalde J.L. 2008. Development of a PCR protocol for the detection of Aeromonas salmonicida in fish by amplification of the fstA (ferric siderophore receptor) gene // Vet. Microbiol. V. 128. Is. 3-4. P. 386-394. DOI: 10.1016/j.vetmic.2007.10.004

8. Byers H.K., Gudkovs N., Crane M. St.J. 2002a. PCR-based assays for the fish pathogen Aeromonas salmonicida. I. Evaluation of three PCR primer sets with infected fish for detection and identification // Dis. Aquat. Org. V. 49 (2). P. 129-138.

9. Byers H.K., Cipriano R.C., Gudkovs N., Crane M. St.J. 2002b. PCRbased assays for the fish pathogen Aeromonas salmonicida. II. Further evaluation and validation of three PCR primer sets with infected fish // Dis. Aquat. Org. V. 49 (2). P. 139-144.

10. Du Y., Liu P., Meng L., Sharawy Z., Liu Y. 2018. Colonization of Aeromonas salmonicida subsp. masoucida strains in Atlantic salmon (Salmo salar L.) during infection // Aquaculture Research. V. 49. Iss. 5. Р. 1826-1833. DOI: 10.1111/ARE.13637.

11. Gulla S., Lund V., Kristoffersen A.B., Sorum H., Colquhoun D.J. 2016. vapA (A-layer) typing differentiates Aeromonas salmonicida subspecies and identifies a number of previously undescribed subtypes // J. of Fish Dis. V. 39. Iss. 3. P. 329-342. DOI: 10.1111/jfd.12367.

12. Gustafson C. E., Thomas C. J., Trust T. J. 1992. Detection of Aeromonas salmonicida from fish by using polymerase chain reaction amplification of the virulence surface array protein gene // Appl. and Environ. Microbiol. V. 58. No 12. Р. 3816-3825. DOI:10.1128/aem.58.12.3816-3825.1992.

13. Hiney M., Dawson M.T., Heery D.M., Smith P.R., Gannon F., Powell R. 1992. DNA probe for Aeromonas salmonicida // Appl. Environ. Microbiol. V. 58. P. 1039-1042. DOI: 10.1128/aem.58.3.1039-1042.1992.

14. Høie S., Dalsgaard I., Aase I.L., Heum M., Thornton J.M., Powell R. 1999. Polymerase chain reaction (PCR)-based typing analysis of atypical isolates of the fish pathogen Aeromonas salmonicida // Syst. Appl. Microbiol. V. 22. Iss. 3. P. 403-411. DOI: 10.1016/S0723-2020(99)80049-6.

15. Miyata M., Inglis V., Aoki T. 1996. Rapid identification of Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida by the polymerase chain reaction // Aquaculture. V. 141. Iss. 1-2. P. 13-24. DOI: 10.1016/0044-8486(95)01221-4

16. Mooney J., Powell E., Clabby C., Powell R. 1995. Detection of Aeromonas salmonicida in wild Atlantic salmon using a specific DNA probe test // Dis. Aquat. Organ. V. 21. No. 2. P. 131-135.

17. Steinum T., Sjåstad K., Falk K., Kvellestad A., Colquhoun D.J. 2009. An RT PCR-DGGE survey of gill-associated bacteria in Norwegian seawater-reared Atlantic salmon suffering proliferative gill inflammation // Aquaculture. V. 293. Iss. 3-4. P. 172-179. DOI: 10.1016/j.aquaculture.2009.05.006.

18. Tiirola M., Valtonen E.T., Rintamäki-Kinnunen P., Kulomaa M.S. 2002. Diagnosis of flavobacteriosis by direct amplification of rRNA genes // Dis. Aquat. Organ. V. 51. No. 2. P. 93-100.